噬菌体抗体库筛选技术研究进展 - 文章编号1007-8738(2005)S-0058

噬菌体抗体库筛选技术研究进展 - 文章编号1007-8738(2005)S-0058

S58

文章编号:1007-8738(2005)S-0058-02

噬菌体抗体库筛选技术研究进展

薛国柱综述 窦科峰审阅(第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安710032)

[关键词] 噬菌体库;抗体;抗体筛选;肿瘤[中图分类号] Q782   [文献标识码] A

  噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体

(scFv)的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库[1]。经特定抗原或细胞筛选后,便可获得特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤

[2,3]

1 噬菌体呈现人抗体库的基本原理

噬菌体抗体在膜表面表达,是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合,又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性,以靶抗原通过亲和吸附2洗脱2扩增,可筛选到靶分子的配体肽链[4]。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力,最终便获得高亲和力的特异性抗体。

噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤:淘筛和鉴

定[5]。淘筛(panning)是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共同孵育,通过几轮洗脱,收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增,再进行下一轮的淘筛。经几轮淘筛后,便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板、挑选,即可得到高特异性单克隆菌株。

2 噬菌体抗体库的筛选方法

噬菌体抗体库的筛选,需要对许多条件优化,包括噬菌体的制备及其滴度,其中更重要的是要优化筛选策略。

2.1 固相或液相纯化抗原的筛选 用纯化或重组的抗原从

噬菌体抗体库中筛选展示特异性抗体的噬菌体的传统方法主要有:(1)将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。(2)将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链亲和素(streptavi2

din)的磁珠上对噬菌体进行筛选。生物素化的抗原与磁珠结

合后,再通过磁场的作用将结合抗原的噬菌体与未结合抗原的噬菌体分开

[6,7]

。为了提高的筛选效率,可对固体筛选的

传统方法不断改进,如将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过

程相联合,可产生选择性感染噬菌体(selectivelyinfected

收稿日期:2004-03-22; 修回日期:2004-05-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30371399)

作者简介:薛国柱(1966-),男,河南新野人,副主任医师,博士生.

Tel:(029)83375259;Email:xgzh2003@http://www.wendangwang.com

phage,SIP)筛选系统

[8]

。针对细胞表面抗原等抗原难以纯化

的,可采用抗抗体替代抗原进行筛选[9]。

传统筛选系统中,基因重组噬菌体中会有野生型的pⅢ蛋白存在,因此,重组噬菌体仍具有感染能力。这样在筛选后扩增时,特异性和非特异性的噬菌体均可进入宿主菌增殖。

SIP筛选系统,是将筛选和扩增合并为一步,只有特异性的噬

菌体才能感染宿主菌中扩增,而非特异性的噬菌体则不能。这样,不仅可简化筛选的步骤,而且可大幅度地提高筛选效率[8]。另一种思路是用抗独特型(anti2idiotypic,AId)抗体替代细胞表面的抗原进行筛选。在抗细胞表面抗原的mAb可以制备并提纯的条件下,用该mAb作为抗原进行免疫反应也可得到抗体。抗抗体的某些表位和抗原的一些表位可以采用经典的方法进行筛选。Hombach等[10]以抗CD30的抗抗体替代

CD30(在Hodgkin淋巴癌细胞膜上过度表达)筛选抗CD30的scFv噬菌体抗体库,仅1轮筛选就获得了亲和性较高的抗CD30scFv。

2.2 全细胞筛选 目前文献报道的特异性噬菌体抗体,多数

是由固相纯化抗原筛选得到的。对于无法提纯或抗原性质不确定的抗原(如癌细胞表面受体),采用传统的筛选方法可使抗原失活,如某些膜蛋白,因此,需建立新的筛选系统或对传统的筛选技术进行改进[10,

11]

由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同,对未知抗原的分离鉴定有很大困难,因而在很长一段时间内抗体库没有被用于对肿瘤特异性抗体的筛选[11]。最近,直接用肿瘤细胞从单链噬菌体抗体库中筛选肿瘤特异性抗体已有报道。如Kupsch等[12]筛选出与黑色素瘤细胞特异性结合的抗体。Ridgway等[13]采用先将正常支气管上皮细胞系与非特异性的噬菌体抗体清除后,再用肺腺癌细胞系进行筛选的方法,得到抗CD55的单链抗体。但即使这样,其筛选效率仍较低,而且容易丢失亲和性高的噬菌体。Siegel等报道了磁性细胞分离法(magnetically2activatedcellsorting,MACS)。即用抗原阳性的细胞包裹磁珠,然后与大量抗原阴性的细胞混合,加入待筛选的噬菌体作用后,再通过磁柱快速分离结合特异性噬菌体的抗原阳性细胞。他们采用MACS法,以人血红细胞

Rh(D)+

细胞为靶细胞,Rh(D)-

细胞吸收非特异性噬菌体,

成功地从Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列抗Rh(D)的抗体。

研究表明,噬菌体抗体库不仅可通过与细胞结合进行筛选,而且可通过细胞内化进行筛选[14]。由于配体和受体结合后可经细胞内化的方式将配体2受体的复合体吞入细胞内。而抗体与抗原的结合可模拟这一过程,故可采用这一方法来筛选可被细胞内化的抗体。本法的基本步骤是:先用不表达某一抗原的细胞吸附抗体库后,再将吸附后的抗体库与表达某一抗原的细胞于37℃孵育15min,以使特异性抗体被内化入细胞。然后用酸性洗脱液洗去与细胞膜非特异结合的噬菌体

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