去除蛋白质的方法

去除蛋白质的方法总结

去除蛋白质的方法 Folin—酚试剂法(Lowry 法) (一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。 过去此法是应用最广泛的一种方法, 由于其试剂乙 的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即 Folin—酚试剂,以增加显色量,从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:?在碱性条件下,蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪 氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,蓝色深 度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长, 要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素(0.5%), 硫酸纳(1%),硝酸纳 (1%), 三氯乙酸(0.5%), 乙醇 (5%), 乙醚(5%) , 丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅, 则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时,加 F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定,但上 述还原反应只在 pH=10 的情况下发生,故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中 时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前,还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定范围是 20~250mg。 (二)试剂与器材 1.试剂 (1)试剂甲: (A) 10 克 Na2CO3,2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6·4H2O)。溶解 于 500 毫升蒸馏水中。 (B) 0.5 克硫酸铜 (CuSO4·5H2O) 溶解于 100 毫升蒸馏水中, 每次使用前, 50 份 将 (A) 与 1 份(B)混合,即为试剂甲。 (2)试剂乙: 在 2 升磨口回流瓶中,加入 100

克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25 克钼酸钠(Na2MoO4·2 H2O)及 700 毫升蒸馏水,再加 50 毫升 85%磷酸,100 毫升浓盐酸,充分混合,接上回流 管,以小火回流 10 小时,回流结束时,加入 150 克 硫 酸 锂(Li2SO4),50

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