细菌基因组DNA提取及分光光度法定量

基因工程实验

细菌基因组DNA提取及分光光度法定量

一、目的

1. 熟悉并掌握SDS裂解法提取细菌基因组DNA的基本方法。

2. 了解基因组DNA的分光光度法定量及荧光检测。

二、原理

基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大,以此增加外源基因获得率,但要获得大片段的DNA非易事。细菌基因组是环状DNA,在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA。因此要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA分子的可能性;分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量,所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子,起到抑制核酸酶活性的作用。

制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的,以满足基因工程中各种酶反应的需要,制备的样品必须没有蛋白污染,没有RNA,各种离子浓度应符合要求,这些在染色体制备时都应考虑到。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞,然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)及CTAB破裂细胞,SDS具有的主要功能是:(1)溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;(2)解聚细胞膜上的脂类和蛋白质,有助于消除染色体DNA上的蛋白质;(3)SDS 能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净。

“CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂,可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里,在高离子强度的溶液里,CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。因此,CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括E.coli的某些株)中制备纯化DNA”

破细胞后蛋白质经等体积苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去,之后用洒精沉淀回收DNA。

如果要对提取出的DNA进行PCR等试验,要在破壁后用RNase和蛋白酶k将体系中的RNA及蛋白降解。

定量测定DNA时需要读取260nm、280nm和310nm三个波长下的读数。根据在260nm和310nm处的读数可计算出样品中的核酸浓度,1OD值相当于50μg/ml双链DNA。利用260nm和280nm两处读数的比值(OD260:OD280)可估计核酸的纯度。DNA纯制品的OD260:OD280值为1.8,若样品中蛋白或酚的污染较严重则OD260:OD280低于两个数值,若高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽,就不可能通过分光光度法进行精确定量。通过计算可确定DNA样品浓度,公式如下:

对于ssDNA:[ssDNA]=33×(OD260- OD310)×稀释倍数

对于dsDNA:[dsDNA]=50×(OD260- OD310)×稀释倍数

对于ssRNA: [ssRNA]=40×(OD260- OD310)×稀释倍数

以上浓度单位为μg/mL。

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