N_氨甲酰_D_氨基酸酰胺水解酶的融合表达_纯化和酶活性

研究

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纯化和酶活性!"氨甲酰"#"氨基酸酰胺水解酶的融合表达、

钮利喜

石亚伟

袁静明

(山西大学生物技术研究所,太原","""%)

(23456)摘要:将菌株--+./0的1+氨甲酰+2+氨基酸酰胺水解酶基因插入到789:+;(<载体中,(8=>)该重组子在!"#$%&=:(!中的表达产物为融构建表达产物为麦芽糖结合蛋白与23456融合的重组子。合蛋白8=>+23456’?%@)A4*,光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的!&B。经9CD#根据789:+;(<的背景,用G4;H./<4剪切后,可E.56亲和纯化和-F76/.56!(凝胶排阻层析后达到了电泳纯。

得约)!@?A4的8=>和,)@?A4的23456。酶活性检测表明当用1+氨甲酰+2:+缬氨酸做为底物I9%""J!"时,每升菌体每小时可产生2+缬氨酸"@?$K。

关键词:789:+;(<质粒;1+氨甲酰+2+氨基酸酰胺水解酶;麦芽糖结合蛋白;融合表达;亲和层析

中图分类号:L,)(M@,

文献标识码:9

!+内酰胺类抗生素是在世界范围内广泛使用的

抗菌类药物。其中I半合成抗生素如阿莫西林’4C.N0;0EE0O*因其易口服和溶血性好等特点而成为制药工业关注的焦点P!I(Q。阿莫西林是由2+对羟基苯甘氨酸’2+7+RDS/.ND7R6ODE+KED;0O6I2+T>U*与青霉素的母核%+氨基青霉烷酸’%+4C0O.+76O0;0EE0;4;0SI%9>9*两部分缩合而成I具光学活性的2+T>U是以2:+对羟基苯海因’2:+RDS/.ND+7R6ODERDS4O#H.0OI2:+T>T*作为前体I通过内酰胺脲转化反应P,Q而生成。实现这一转化可采用以下几种方法V一种是化由于没有大批量及学合成I目前主要采用乙醛酸法P)Q。

高质量的乙醛酸供应I使下游产品的价格优势得不到充分发挥I影响产品的市场发展W另一种是化学和酶法相结合I先采用海因酶将底物首先转化成1+氨甲酰+2+对羟基苯甘氨酸I再用化学法切除氨甲酰基I但化学法反应条件激烈且产率低;第三种是双酶法I又称一步转化法I即利用海因酶’2+TDS4OH.0O456IT2X456*和1+氨甲酰+2+氨基酸酰胺水解酶’2+34/Y4C.DE456I23456*两酶同时催化Z’+替代海因形成2+T>UPZQ’G0K@!*。首先在海因酶的作用下I使2:+T>T变为1+氨甲酰+2+对羟基苯甘氨酸’37T>U*I之后在23456的作用下生成2+T>U。由于一步转化法条件温和I收率高I已被企业界广泛采用。用一菌一步转化生产2+T>U已有不少报道

收稿日期:("",+"$+"!

(("",!")()基金项目:山西省自然科学基金资助项目。

在读硕士研究生。研究方向:基因工程药物。作者简介:钮利喜,男,生于!&?$年,

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N_氨甲酰_D_氨基酸酰胺水解酶的融合表达_纯化和酶活性

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由于天然菌株具有一些难于克服的缺陷P(QI因此I利用219重组技术构建具有一定特点的工程菌用于生物

转化生产2+T>U的报道日益增多PZI!"Q。

本文将生产菌株--+./0的23456基因克隆到789:+;(<载体中I然后在!"#$%&=:(!中进行融合表达并测定了23456的酶活。

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