ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用

ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用

实验二 ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用

一、实验原理

1991年,Hulton(6)等人首次在E. coli, Salmonella typhimurium及其它肠道细菌基因组中发现了ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)序列,即肠杆菌基因间保守重复序列。同年,Versalovic等人(8)发明针对ERIC序列设计引物并进行PCR扩增的技术,以用于对细菌的基因组DNA进行指纹图分析,并将该技术申报专利。此后,ERIC-PCR技术就被广泛应用于细菌分类和菌种鉴别上(2)。

1997年,Gillings 和 Holley发现(5), ERIC-PCR可以从植物、脊椎动物、无脊椎动物、真菌等物种的基因组DNA中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱,而这些生物的基因组中是没有典型的ERIC重复序列的。因此,并不需要有ERIC序列就可以获得多态性丰富的、可以反映底物序列差异的图谱。Gillings 和 Holley还进一步证实,ERIC-PCR不是一种专门扩增ERIC序列的技术,它与其它多种针对重复序列的PCR分型技术,例如REP-PCR、BOX-PCR等一样,实际上是一种“长引物随机PCR技术(long primer RAPD, LP-RAPD)”(4)。长引物随机PCR技术与普通RAPD技术不同之处有两个:1)使用一对长度大于16 碱基的引物,而不是普通RAPD那样的长度只有8-10个碱基的单个引物;2)退火温度高于52℃,而不是普通RAPD的低于40℃。正是由于这两个特点,这种长引物随机PCR技术与普通的RAPD技术相比,具有图谱稳定、重复性高,对底物的序列差异敏感性高以及产生的图谱多态性丰富等特点。

1999年,ERIC-PCR首次被用于分析混合菌群(2)。Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成,获得了高重复性的指纹图谱,该指纹图谱与ARDRA及常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。Di Giovanni 还用ERIC-PCR成功分析了接种不同植物根际微生物的BIOLOG GN板不同点样孔中菌群组成的差异(1),提示ERIC-PCR指纹图谱技术将会成为一项比较细菌群落组成的有效的方法。本实验室经过反复摸索和优化,首次将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究。该方法的理论依据为:用ERIC-PCR技术研究自然界复杂环境样品,首先需直接提取优质的环境样品中微生物的总基因组DNA,其中 DNA分子的种类及各分子的相对比例反应了环境样品中菌群的种类数量及种群之间的相对比例,这样便提取到生态系统中微生物群落结构的组成信息。不同的环境样品DNA分子的组成及相对数量不同,重复序列在不同基因组DNA分子中分布及拷贝数均不相同,

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