实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察

实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察

1. 目的要求

(1)学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。

(2)掌握细菌的简单染色法,初步认识细菌的形态特征。

(3)了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰氏染色的方法。

2. 基本原理

(1)简单染色法

用单一染料进行细菌染色,操作简便,适于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色,这是因为:在中性、碱性或弱碱性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时,其分子的染色部分带正电荷),因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色,经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。

(2)革兰氏染色法

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料初染液;媒染剂;脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。

3. 材料及器材

(1) 大肠杆菌,枯草芽孢杆菌

(2) 革兰氏染色液,载玻片,显微镜等

4. 方法与步骤

Ⅰ 涂片 取两块载玻片,各滴一小滴蒸馏水于玻片中央,用接种环以无菌操作分别从培养14~16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中,混匀并涂成薄膜。

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