细菌扫描电镜步骤

细菌扫描电镜步骤

实验前准备:

①玻片处理:将盖玻片折成1*1cm的小方块,用1M HCL 浸泡过夜,第二天用无水乙醇冲洗几次,再用超声破碎处理30min(300W,3s超声3s暂停),后将清洗过的盖玻片取出,置于网格铁网(或者干净的小烧杯或培养皿,反正到时用镊子拿的时候不要粘底就好),于烘箱中烘干备用。

细菌扫描电镜步骤

④2.5%戊二醛的配制:按25%戊二醛:无菌水:0.2M PBS溶液=1:4:5配制。

⑤梯度洗脱酒精:配制30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精,无菌水稀释。 步骤:

1、细菌处理和固定:细菌活化待用,扩培至对数期后取出1ml菌液(根据情况,上次差不多OD值目测在0.5的样子,如果菌液浓的话相应取少一点),8000rpm室温离心1min,取出850ul培养基,加入150ul多肽,混匀后37℃孵育半小时(根据实际情况调整药物浓度和孵育时间)。8000rpm室温离心1min,弃上清,加入2.5%戊二醛(此步骤前感觉应该用PBS洗涤几次,但当时没有做),混匀,4℃过夜固定。

2、乙醇梯度脱水:固定后8000rpm离心1min,去上清,PBS溶液清洗三次,按30%、50%、70%、80%、90%的顺序梯度脱水,每次加入后静置15min,8000rpm离心1min,最后100%乙醇洗涤两次,条件同前,最后用300~600ul无水乙醇重悬浮待用。

3、取一大的干净培养皿,贴双面胶并做好标记,用扁头镊子小心夹取盖破片,粘住双面胶小角即可(起固定作用,不要粘太多,不然不好取片),一般一个样品准备三个盖玻片备用,后将上步所得重悬菌液吸取7~10ul,滴加于玻片表面,保鲜膜封口,烘箱烘干备用。

4、上电镜。

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