甜菜碱提高长距离PCR扩增效率的研究

目的:利用甜菜碱优化长距离PCR(LD-PCR),提高血友病A(HA)基因倒位检测效率。方法:在LD-PCR反应体系中加入DMSO、甘油及不同浓度的甜菜碱进行LD-PCR扩增,比较扩增结果。用甜菜碱优化LD-PCR检测正常人、不同程度HA患者及携带者的FⅧ基因是否存在FⅧ基因22号内含子(IVS22)倒位。结果:在反应体系中加入甜菜碱可获得更好的LD-PCR扩增结果;甜菜碱优化LD-PCR的最佳终浓度为0.8~

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实用医学杂志 20 0 8年第 2 4卷第 l 7期

基础研究

甜菜碱提高长距离 P R扩增效率的研究 C 吴 摘

李强徐秀月刘卓刚

要目的:用甜菜碱优化长距离 P R ( D P R)提高血友病 A( A)因倒位检测效率。方法: L—利 C L—C, H基在 D

P R反应体系中加入 D S甘油及不同浓度的甜菜碱进行 L—C C M O、 D P R扩增 .比较扩增结果用甜菜碱优化 I P R—C 检测正常人、同程度 H患者及携带者的 F基因是否存在 F基因 2不 AⅧⅧ 2号内含子 (V 2 )位结果:反应体 IS 2倒在

系中加入甜菜碱可获得更好的 L—C D P R扩增结果;菜碱优化 L—C甜 D P R的最佳终浓度为 08~1 o/: . . m lL应用甜 8

菜碱优化 L—C D P R检出 3例 H A患者、 2例携带者和 1可疑携带者 F例Ⅷ基因有 I S 2倒住。结论: V2一定浓度的甜 菜碱可以显著提高 L—C D P R的扩增效率,高检测出 H提 A患者的 FⅧ基因 IS 2倒位的效率 V2 关键词血友病 A甜菜碱 L—C DP R L i g 1Qo,XU X uge 1  ̄ i—u,LU

Th m pr v d f c e c o ong d san e PCR b t i W U n, YANG W e ei oe e i i n y f l it c by e ne a Bi i

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Z u— n . D pr e tfH m toy h aMeia U i r t, ̄n n opt, hnag 10 0 C i h og g a e at n e oo g,C i d l nv sy S vi H si S ey n 1 04 hn m o l n c ei g l a a

【 s at 0bet e oipoet fc n yo n i ac o m rs h i rat n( D P R)b s g Abt c】 r jc v T rv ee ie c fogds nep l eaecan eci L—C i m h i l t y o yui n b ti e M e h d T e P n a c r, ea n . to s h CR e h n e s l e d meh l s l h xd, gy e o, b ti e n ea n f dfee t i i ty u p o i e l c r l k ean a d b ti e o i r n

c n e t t n r u n o t e L P x u e. te h e u t o mp i c t n w r o a e . T e i r v d L o c nr i swe e p tit h D— CR mit r ao h n t e r s l fa l a i e e c mp r d h mp o e D— s i f o

P a s d t ee ti I 2 a rsn n te F g n ften r lc nrl .h mo h l ainso iee t CR w su e od tc f VS 2 w spee ti hⅧ e e o h oma o t s e p ia A p t t fdf rn o i e i s v rt s a d c rir . Re u t B t r r s l o D— C w s f u d i h xu e c n an n ea n. t a a i e e i e n a r s i e sl s e t e u t fL P R a o n n t e mi tr o ti i g b ti e h n t tw t h h oh rP n a c ro t o t CR e h n e . T e b s o c n r t n o ea n h t n a c d L P s0 8~ 18 t e CR e h n e rwi u h P n a c r h e tc n e tai fb ti e ta h n e D— CR wa . o e . mo/ l L.I 2 n e in wa e e td i h e h mo h l ai n s wo c ri ra d o e p s i l a re .Co cu i n VS 2 i v r o s d tce n t r e p i a A p t t .t are n n o sb e c ri r s e i e n l so B t ie o e ti o c n r t n c n s n f a t mp o e te e ce c f L P R a l i ain a d d tc in o h e an f c r n c n e tai a i i c n l i r v h f i n y o D— C mpi c t n ee t f t e a o g i y i f o o I S 2 i v ri n e ce t n o r c l. V 2 n e so f in y a d c re t i l y

【 ywod】 He o h i A B tn L— R Ke r s m p ia e ie D P l a C

血友病 A( HA)由凝血因子 F基因缺陷引起是Ⅷ

的 x连锁隐

性遗传病 .男性中发病率为 1 5 0 ./ 0根 0据患者血浆中 FⅧ促凝活性及症状严重程度分为轻、 中、 3型,别占 4%、0重分 0 1%和 5%…,型者常因 0重 反复自发性关节出血致残,因颅内或内脏出血危及生命。有报道在重型 H A患者中约有 3 . 9%是由 F 4Ⅷ基因的 2内含子 (V 2 ) 2号 I S 2倒位引起。以往检测 I S2 V 2倒位多用 Suhr oten印迹杂交的方法 .但该方法周期长,使用放射性物质。19年 Lu等提出了直接且 98 i检测 I S 2倒位的长距离 D A P R (ogds n e V2 N C 1 i a c n t P R, D P R)术,扩增片段长达 1 0 p和 C L .C技但 10 0 b 1 0 p且含有 35 0b 200b, 0 p的高 G C区,增难度很扩

为携带者,母为可疑携带者,国际公认诊断标准:姨按 P T正常 .P延长 .凝血活酶生成实验及纠正实验 A1检查 F缺乏,Ⅷ确诊为 H国际通用的一期法测患者 A,血浆中 F:平,按照 WHⅧ C水 O标准,Ⅷ: F C<1%为重型,%~5 1%为中型,%~2%为轻型。 A组 1 6 5 H 6个家系中,型 9例,带者 5例,疑携带者 2例;重携可中

大。本研究在 L .C D P R反应体系中加入高效的 P R增 C强剂甜菜碱,并在优化后的反应条件下检测了 1 6个 H A家系的 IS 2位情况 .告如下。 V2倒报 1对象与方法

11对象正常对照组 2 . 0例为无凝血异常、遗传无性疾病及家族史者。 HA组无血缘关系家系 .患者母亲

作者单位: 10 4沈阳市 .中国医科大学附属盛京医院血液内 l0 0 科(吴斌,杨威,秀月,徐刘卓刚)检验科 (。李强)

型2,例携带者 1;例轻型 5,例携带者 1 例。 12主要仪器和试剂 P R仪为德国 Wht n . C a ma Bo t i r司的 T R D E T 6梯度 P R仪, me a公 G A IN 9 C电泳凝胶成像系统为美国柯达公司产品,心机为美国杜邦离公司 R一8型高速冷冻离心机。主要试剂长链 D A C2s N聚合酶和 G ufr大连宝生物工程有限公司产 Cbf为 e品,菜碱和 D O为美国

Sg公司产品。其他试甜 MS i ma剂为实验室常规试剂。 1 D A提取采静脉血 2mL E T . 3 N . D A抗凝,和氯饱化钠提取基因组 D A。取 05m N . L抗凝全血加入 08 . mLp . T H 80的 E缓冲液 .匀后 .温离心 1 0 混室 00 0r/ mn 1 n弃上清,入 T i.。 mi加 E缓冲液 04mL悬浮细胞 .,后加入终浓度 1 0l/ 0 g mL蛋白酶 K.终浓度 05 x .%十二烷基磺酸钠并轻轻混匀。3℃水浴过夜。加入1 3 7/体积饱和氯化钠并充分混匀,℃静置 1 i 4 0 mn, 1 0 mn离心 1 i。 000r i/ 0mn取上清液于新试管内,入加

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