质粒浓度测定

用分光光度计测定质粒DNA的浓度

一、目的

熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。

二、原理

DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。对标准样品来说,浓度为1μg / ml时,DNA钠盐的OD260=0.02当OD260=1时,

dsDNA浓度约为50μg / ml

ssDNA浓度约为37μg / ml

RNA浓度约为40μg / ml

寡核苷酸浓度约为30μg / ml

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯度。经验值:

纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:1.7 <OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)

若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量。

三、材料、试剂及器具

1、 材料

提取的PUC19样品、PUC19标准样品

2、 试剂

灭菌重蒸水,TE缓冲液

3、 器皿

石英比色皿;UV-240紫外分光光度计

四、操作步骤

1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.

2、 用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后,放入样品室的S池架上,关上盖板。

3、 设定狭缝后校零。

4、 将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl)后,记

录编号和稀释度。

5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板。

6、 设定紫外光波长,分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。

7、 计算待测样品的浓度与纯度。

DNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000

RNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×40/1000

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