PCR引物设计方法综述

农业基础科学现代农业科技2011年第17期

PCR引物设计方法综述

尤超

赵大球

梁乘榜

周春华

*

(扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009)

摘要为了获得PCR引物设计的理想方法,笔者运用NCBI等数据库与引物设计软件PrimerPremier5.0等工具,结合引物设计的原则,完成目的基因的引物设计,并对设计后的引物进行BLAST比对、综合评价和基因的重新检测等分析,据此对PCR反应条件进行优化研究。结果表明,通过这些数据库和软件所设计的引物能基本满足后续的RT-PCR反应,可以进行进一步的分子生物学研究。

关键词PCR;引物设计;软件;分子生物学中图分类号S188文献标识码A文章编号1007-5739(2011)17-0048-04

YOUChao

ReviewofthePCRPrimerDesignMethod

ZHAODa-qiuLIANGCheng-bangZHOUChun-hua*

(CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,YangzhouJiangsu225009)

AbstractInordertoobtainanidealmethodofPCRprimerdesign,theauthorcompletedprimerdesignoftargetgene,usingsomedatabasesandsoftwaretoolsforprimerdesign,suchasNCBI,PrimerPremier5.0andsoon,combinedwiththeprincipleofprimerdesign.ThenmadearesearchonoptimizationofconditionsforPCRreactionafterthedesignedprimerwasanalyzedthroughBLASTcomparison,comprehensiveevaluationandgenere-

testanalysis.TheresultsindicatedthatprimersdesignedthroughthesedatabasesandsoftwarescouldbasicallymeettherequirementsoffollowingRT-PCRreaction,andcouldmakeanin-depthstudyofmolecularbiology.

KeywordsPCR;primerdesign;software;molecularbiology

聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术,具有快速、简便及高度敏感等优点,能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此,其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。近年来,该技术在相关领域得到了广泛应用,并大大推进了分子生物学和相关领域的研究和发展。众所周知,引物设计是影响PCR试验的重要参数之一[3]。目前,虽然引物设计软件的功能都非常完善,但是关于计算机引物设计程序的文献还不多,初学者具体操作起来还是会觉得比较复杂,该文拟对引物设计的原则和软件的使用方法进行深入地探索和分析。

内切酶的酶切位点[5],有利于定向克隆,加入的酶切位点不能与引物内部形成互补结构[6],并且所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点,最好载体其他地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些,并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点,为日后研究该基因的后续实验奠定基础。

通常情况下,研究者进行引物设计的基因涉及到很多种类型,既有结构基因又有非结构基因,结构基因和非结构基因又包括多个基因,都必须综合分析。以上便是研究具体基因的目的及意义,即所设计引物的基因必须要在相关领域有自身的研究和应用价值。

1具体基因引物设计的目的和意义

在准备基因引物设计前,要非常清楚地了解其研究的

2引物设计总体概述

并不是所有研究都有可以借鉴的通用基因。由于所探

宗旨和意义,首先要查阅大量的文献,明确该基因的相关理化特性。以研究银杏的顺式-异戊烯基转移酶(cis-prenyltran

索的科学问题不同,突破点和侧重点也就不一样,往往就需要根据不同的研究目的和意义进行引物设计。如研究植物的多倍化与杂交,就需要设计单拷贝核基因的引物;而研究多基因家族进化,就需要设计可以扩增这一基因家族不同基因的引物等[7]。

sferase,CPT)为例,通过相关文献了解到,它是聚戊烯醇合

成的第一个关键酶,分别从法尼基焦磷酸(Farnesylpyropho

sphate,FPP)或牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(Geranylgeranylpyr-ophosphate,GGPP)形成聚戊烯醇、甾醇、类胡萝卜素、叶绿

素、萜类、泛醌等物质。目前对CPT的研究较少,Oh等[4]从拟南芥中分离和鉴定了CPT,而NCBI中尚无银杏CPT序列的记载,通过从银杏叶中克隆CPT进行基因表达调控和功能分析研究,对于探讨银杏聚戊烯醇的合成代谢具有重要的意义。

其次,在进行引物设计之前必须弄清楚是否要进一步用于克隆或表达。若要用于克隆,引物5′端最好加上限制性

基金项目

江苏省自然科学基金资助项目(BK2008213);江苏省教育厅高校自然科学基金资助项目(08KJD220002);扬州大学科技创新培育基金资助项目(2007CXJ018,2009CXJ030)。尤超(1987-),男,安徽灵璧人,在读硕士研究生。研究方向:银杏次生代谢调控。*通讯作者

2.1进行引物设计的主要数据库和生物软件

目前,进行引物设计时模板选择有2种情况:一种是扩

增已知基因,需要在GenBank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA作为模板来设计引物;另一种是扩增未知基因,需根据比较基因组定位的原理,选择研究深入的高等动植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物[8]。

虽然引物设计模板选择有很多,但是无论何种情况,都要涉及引物设计软件。通过搜集大量的信息资源,当前进行引物设计的国际三大核酸数据库分别为NCBI(http://www.

作者简介

ncbi.nlm.nih.gov)、DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp)、EMBL(http://www.ebi.ac.uk/embl),生物软件有:BlockMaker(http://http://www.wendangwang.com/blocks/makeblocks.html或http://http://www.wendangwang.com/block(:48

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