农业基础科学现代农业科技2011年第17期

PCR引物设计方法综述

尤超

赵大球

梁乘榜

周春华

*

（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州225009）

摘要为了获得PCR引物设计的理想方法，笔者运用NCBI等数据库与引物设计软件PrimerPremier5.0等工具，结合引物设计的原则，完成目的基因的引物设计，并对设计后的引物进行BLAST比对、综合评价和基因的重新检测等分析，据此对PCR反应条件进行优化研究。结果表明，通过这些数据库和软件所设计的引物能基本满足后续的RT-PCR反应，可以进行进一步的分子生物学研究。

关键词PCR；引物设计；软件；分子生物学中图分类号S188文献标识码A文章编号1007-5739（2011）17-0048-04

YOUChao

ReviewofthePCRPrimerDesignMethod

ZHAODa-qiuLIANGCheng-bangZHOUChun-hua*

（CollegeofHorticultureandPlantProtection，YangzhouUniversity，YangzhouJiangsu225009）

AbstractInordertoobtainanidealmethodofPCRprimerdesign，theauthorcompletedprimerdesignoftargetgene，usingsomedatabasesandsoftwaretoolsforprimerdesign，suchasNCBI，PrimerPremier5.0andsoon，combinedwiththeprincipleofprimerdesign.ThenmadearesearchonoptimizationofconditionsforPCRreactionafterthedesignedprimerwasanalyzedthroughBLASTcomparison，comprehensiveevaluationandgenere-

testanalysis.TheresultsindicatedthatprimersdesignedthroughthesedatabasesandsoftwarescouldbasicallymeettherequirementsoffollowingRT-PCRreaction，andcouldmakeanin-depthstudyofmolecularbiology.

KeywordsPCR；primerdesign；software；molecularbiology

聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。近年来，该技术在相关领域得到了广泛应用，并大大推进了分子生物学和相关领域的研究和发展。众所周知，引物设计是影响PCR试验的重要参数之一[3]。目前，虽然引物设计软件的功能都非常完善，但是关于计算机引物设计程序的文献还不多，初学者具体操作起来还是会觉得比较复杂，该文拟对引物设计的原则和软件的使用方法进行深入地探索和分析。

内切酶的酶切位点[5]，有利于定向克隆，加入的酶切位点不能与引物内部形成互补结构[6]，并且所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，最好载体其他地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些，并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点，为日后研究该基因的后续实验奠定基础。

通常情况下，研究者进行引物设计的基因涉及到很多种类型，既有结构基因又有非结构基因，结构基因和非结构基因又包括多个基因，都必须综合分析。以上便是研究具体基因的目的及意义，即所设计引物的基因必须要在相关领域有自身的研究和应用价值。

1具体基因引物设计的目的和意义

在准备基因引物设计前，要非常清楚地了解其研究的

2引物设计总体概述

并不是所有研究都有可以借鉴的通用基因。由于所探

宗旨和意义，首先要查阅大量的文献，明确该基因的相关理化特性。以研究银杏的顺式-异戊烯基转移酶（cis-prenyltran

索的科学问题不同，突破点和侧重点也就不一样，往往就需要根据不同的研究目的和意义进行引物设计。如研究植物的多倍化与杂交，就需要设计单拷贝核基因的引物；而研究多基因家族进化，就需要设计可以扩增这一基因家族不同基因的引物等[7]。

sferase，CPT）为例，通过相关文献了解到，它是聚戊烯醇合

成的第一个关键酶，分别从法尼基焦磷酸（Farnesylpyropho

sphate，FPP）或牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸（Geranylgeranylpyr-ophosphate，GGPP）形成聚戊烯醇、甾醇、类胡萝卜素、叶绿

素、萜类、泛醌等物质。目前对CPT的研究较少，Oh等[4]从拟南芥中分离和鉴定了CPT，而NCBI中尚无银杏CPT序列的记载，通过从银杏叶中克隆CPT进行基因表达调控和功能分析研究，对于探讨银杏聚戊烯醇的合成代谢具有重要的意义。

其次，在进行引物设计之前必须弄清楚是否要进一步用于克隆或表达。若要用于克隆，引物5′端最好加上限制性

基金项目

江苏省自然科学基金资助项目（BK2008213）；江苏省教育厅高校自然科学基金资助项目（08KJD220002）；扬州大学科技创新培育基金资助项目（2007CXJ018，2009CXJ030）。尤超（1987-），男，安徽灵璧人，在读硕士研究生。研究方向：银杏次生代谢调控。*通讯作者

2.1进行引物设计的主要数据库和生物软件

目前，进行引物设计时模板选择有2种情况：一种是扩

增已知基因，需要在GenBank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA作为模板来设计引物；另一种是扩增未知基因，需根据比较基因组定位的原理，选择研究深入的高等动植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物[8]。

虽然引物设计模板选择有很多，但是无论何种情况，都要涉及引物设计软件。通过搜集大量的信息资源，当前进行引物设计的国际三大核酸数据库分别为NCBI（http：//www.

作者简介

ncbi.nlm.nih.gov）、DDBJ（http：//www.ddbj.nig.ac.jp）、EMBL（http：//www.ebi.ac.uk/embl），生物软件有：BlockMaker（http：//http://www.wendangwang.com/blocks/makeblocks.html或http：//http://www.wendangwang.com/block（：48