鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

第41卷 第7/8期

2011年7月

中国海洋大学学报

PERIODICAL OF OCEAN UNIVERS ITY OF CHINA

41(7/8):101~106

Jul.,2011

鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶M ltD的

表达纯化及生物信息学分析*

徐子男,张晓华

**

(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

摘 要: 本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET 32a(+),在大肠杆菌BL21(D E3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS PA GE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌M ltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的M ltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以 螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌M ltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断M ltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。

关键词: 鳗弧菌;M ltD蛋白;原核表达;纯化;生物信息学分析

中图法分类号: Q93;Q178.53 文献标志码: A 文章编号: 1672 5174(2011)7/8 101 06

鳗弧菌(Vibr io anguillar um)是1种革兰氏阴性、嗜盐的海洋鱼类致病菌,它可引起鱼类出血性败血症,即弧菌病,给水产养殖业造成严重的经济损失[1 3]。目前已知的鳗弧菌毒力相关因子主要有铁吸收系统[4]、溶血素[5]、胞外金属蛋白酶[6]以及外膜蛋白、脂多糖和细菌鞭毛等[7]。鳗弧菌的全基因组测序尚未完成,因而对其毒力相关因子的认识还十分有限。为了发现新的毒力相关因子,以更好地研究鳗弧菌的致病机理,在前期研究中,作者利用抑制性消减杂交技术建立了鳗弧菌毒力相关基因文库[8]。利用生物信息学方法对文库中的基因进行初步筛选,选取mltD基因及其编码的膜绑定溶胞壁质转糖酶M ltD作为本次的研究对象。

MltD蛋白是具有溶解肽聚糖功能的糖基转移酶家族(Lytic T ransgly cosylase,LTs)中的一员。该家族的酶类可以裂解肽聚糖中N 乙酰葡糖氨和N 乙酰胞壁酸之间的 1,4糖苷键[9],被认为在大肠杆菌的生长过程中至少2个阶段发挥重要作用:扩大胞壁质和裂解隔膜促使子细胞分离[10]。然而,目前还没有确凿的实验证据表明胞壁质水解酶在细菌的生长过程中是必不可少的,去除1种甚至多种LTs成员都不能导致细菌死亡,猜测LTs成员之间存在相互替代作用[11 12]。也有报道认为LTs能使细菌外膜产生一定的孔隙让新的肽聚糖进入以维持细胞的生长[13]。此外LTs还参与噬菌体的进出和 、 、 型分泌系统的活动,使胞内的一些复合物(如DNA、毒素和鞭毛等)通过其形成的孔隙转运出去[14],推测LTs家族在致病菌胞外产物尤其是毒素的分泌中可能发挥一定的作用。目前,对MltD蛋白的研究还非常少。首次报道是在大肠杆菌中,研究表明M ltD蛋白可水解肽聚糖,并引起细菌细胞裂解[15]。在幽门螺杆菌中,通过基因敲除的方法构建了mltD基因突变株;与野生株进行性质比较,发现MltD蛋白具有转移糖链内部糖基的作用,并由此导致肽聚糖裂解[16]。

本研究将鳗弧菌M ltD蛋白在大肠杆菌中过量表达和纯化,并利用生物信息学方法对其进行了分析,以进一步探讨该蛋白在鳗弧菌致病过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1菌株与质粒

鳗弧菌CW 1由本实验室分离;大肠杆菌JM109、BL21(DE3)和表达载体pET 32a(+)为本实验室保存;载体simple pM D 19T购自大连宝生物工程公司。

1.2主要工具酶及其他试剂

T aq DNA聚合酶、dNT P、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、DNA M arker、蛋白Marker(大连宝生物工程公司);Ni NT A树脂(Nov ag en);其他试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.3鳗弧菌CW 1的mltD基因表达载体的构建

根据鳗弧菌CW 1的mltD基因全长(GenBank登

* **基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2006C B101803);中国科学院实验海洋生物学重点实验室项目资助收稿日期:2010 03 23;修订日期:2010 07 14

作者简介:徐子男(1984 ),女,硕士生,研究方向:海洋微生物学。

通讯作者:E mail:xhzh ang@http://www.wendangwang.com

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