安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(5):1929-1931 责任编辑 常俊香 责任校对 张士敏

8种水稻基因组DNA提取方法的比较

朱世杨,罗天宽,张小玲,陈海英,唐征,刘庆

(温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州325006)

摘要 [目的]寻找操作简便、耗时短、成本低的水稻基因组DNA提取方法。[方法]分别以水稻幼嫩黄化叶片和老叶片为材料,用8种方法提取其中的DNA,测定所提DNA的浓度和纯度,并对其进行PCR扩增和电泳检测,比较各方法的提取效果。[结果]8种方法提取的DNA浓度分别为35.15、30.80、67.30、26.15、23.55、8.95、48.05、54.26Lg/ml,方法»提取的DNA浓度最大,但PCR扩增效果较差;改进的SDS法(方法¿、À)提取的DNA纯度较高,PCR扩增产物电泳条带较亮,但这2种方法操作程序复杂,成本较高,提取每份样品的成本分别为14、31元,远高于其他提取方法。[结论]除方法»外,其余5种简化方法均能得到较高质量的水稻基因组DNA,且提取成本远低于传统SDS法。

关键词 水稻;基因组DNA;提取

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)05-01929-03

Comparisonof8KindsofExtractionMethodsonRiceGenomicDNAZHUSh-iyangetal (KeyLaboratoryofCropBreedinginSouthZhejiang,DepartmentofAgricultureandBio-technology,WenzhouVocationalCollege

ofScienceandTechnology,Wenzhou,Zhejiang325006)

Abstract [Objective]TheaimwastofindtheextractionmethodonricegenomicDNAwithsimpleoperation,shorttimeandlowcost.[Method]Withetiolatedandoldleavesofriceasthematerials,theirDNAwereextractedby8kindsofmethods,theconn.andpurityofextractedDNAweredeterminedandtheextractioneffectsofdifferentmethodswerecomparedbyPCRamplificationandelectrophoresisdetection.[Result]TheDNAconcn.extractedby8kindswere35.15,30.80,67.30,26.15,23.55,8.95,48.05,54.26Lg/mlresp.DNAconcn.extractedbymethod3wasthehighestbutitsexpan-sioneffectbyPCRwasworse.ThepuritiesofDNAextractedbyimprovedSDSmethods(method¿andÀ)washigherandtheelectrophoresisstripoftheirPCRamplifiedproductswerebrighter.Buttheoperatingprocessofthosetwomethodswascomplexwithhighercostandtheircostsextractingpersamplewere14and31yuanresp.farhigherthanthatofothermethods.[Conclusion]Exceptmethod»,other5simplifiedmethodsallcouldobtainhighqualityofricegenomicDNAandtheircostswerefarlowerthanthatofadditionalSDSmethod.Keywords Rice;GenomicDNA;Extraction

水稻是重要的粮食作物,中国稻田面积占世界稻田面积的22%[1]。目前,水稻DNA提取的常用方法有SDS法[2-3]、CTAB法[3]。采用这些方法提取的DNA质量较高,但操作程序繁杂,成本较高,并常伴有药品污染。因此探索成本低、操作简便的DNA提取方法,对水稻分子遗传学研究及分子标记辅助育种具有积极意义。笔者改进陈文岳等[4]、楼巧君等、赫然等、田洁等、杨杰等的水稻DNA提取方法。比较了8种方法提取的DNA的PCR检测结果,并分析了各方法的提取成本,试图找出操作简便、耗时短、成本低的水稻DNA提取方法。1 材料与方法

1.1 材料 黑暗条件下发芽15d的水稻幼嫩黄化叶片和苗龄70d的绿色老叶片。1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法。方法¹参考陈文岳等的方法,有改进。将叶片剪成4段,放入1.5ml离心管中,分别加入40Ll0.25mol/L的NaOH,160Ll100mmol/LTris-HCl,10000r/min离心5min,取上清液30Ll,用ddH2O稀释40倍,4e冰箱中保存备用。

方法º参考楼巧君等的方法,略有改进。将叶片剪成4段,放入1.5ml离心管中,加入200Ll0.25mol/L的NaOH,沸水浴20s;加150Ll0.25mol/L的HCl和150Ll0.5mol/LTris-HC1(pH=8),沸水浴3min,浸出液用作PCR模板。方法»改进楼巧君等和赫然等的方法。取叶片,剪碎置于1.5ml离心管中,分别加100mmol/LTris-HCl(pH=

基金项目 温州科技计划项目(N2006A001)。

作者简介 朱世杨(1982-),男,江苏如皋人,硕士研究生,研究方向:

生物技术与作物育种。[5]

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8),1mol/LKCl,10mmol/LEDTA200Ll。在95e热水中处理

8min,浸出液用作PCR模板。

方法¼参考田洁等[7]的方法,略有改进。将叶片剪碎,置于1.5ml离心管中,分别加入150Ll100mmol/LTris-HCl(pH=8)和0.25mol/LNaOH,10000r/min离心3min,上清液用ddH2O稀释10倍,4e冰箱中保存备用。

方法½参考杨杰等[8]的方法。将叶片剪碎,置于1.5ml离心管中,加入150Ll0.5mol/LNaOH,200Ll1mol/LTris-HC1(pH=8)缓冲液,12000r/min离心8min,上清液用于PCR扩增。

方法¾参考楼巧君等[5]的方法,稍有改动。取叶片置于1.5ml离心管中,加400Ll1.5@CTAB(1.5%CTAB,75mmol/LTris-HCl,15mmol/LEDTA,1.05mol/LNaCl,pH=8),用塑料棒研磨,再加400Ll1.5@CTAB、500Ll氯仿B异戊醇(24B1),摇匀,12000r/min离心5min,取上清液至另一离心管中,用500Ll预冷的异丙醇沉淀,摇匀,12000r/min离心8min。去上清液,沉淀物溶于600LlddH2O中,用作PCR模板。

方法¿参考彭锁堂等[3]的方法,略有改动。称取新鲜水稻叶片,剪碎,置于1.5ml离心管中,把离心管底部置于液氮中预冷,再加入1ml左右的液氮,用塑料棒磨碎,加入600mlSDS提取液,摇匀,65e水浴保温1h,其间每隔10min摇动1次。12000r/min离心5min,取上清,加入500ml酚氯仿(24B1)抽提,12000r/min离心2min,取上清,加1ml100%乙醇,摇匀,12000r/min离心5min,弃上清,用500ml70%乙醇洗1次,弃上清,吸干后加500mlddH2O,-20e冰箱中保存。

方法À参考程保山的方法[9],稍改动。将叶片在-20e预冷的研钵中磨成粉末,将粉末转移到-20e预冷的1.5ml,,间