疫病防治

《饲料工业》 ２００５年第２６卷第２４期

禽流感分子生物学诊断技术研究进展

陈思怀

摘

要

乔宪凤

魏庆信

张

涌

禽流感不但造成养禽业的巨大经济损失，而且也严重威胁着人类公共卫生安全。检测

禽流感病毒是诊断的关键。分子生物学检测技术较常规检测方法快速、准确、灵敏。通过对核酸杂交实时ＲＴ－ＰＣＲ技术、核酸依赖的扩增技术（ＮＡＳＢＡ）、环技术、常规ＲＴ－ＰＣＲ技术、ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ技术、介导的等温扩增技术（ＬＡＭＰ）以及基因芯片等诊断技术的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述，为禽流感的诊断提供参考。

关键词

禽流感；ＰＣＲ；ＮＡＳＢＡ；ＬＡＭＰ；基因芯片

中图分类号

Ｓ８５４．４＋３

（２００１）制备了禽流感核蛋白基因（ＮＰ）的ｃＤＮＡ探针，采用ＤＩＧ标记，建立并优化了检测禽流感病毒（ＡＩＶ）的探针杂交法［４］。当待检样品病毒含量较低时，需要有信号放大的探针技术。目前主要有分支探针［５］（ＢｒａｎｃｈｅｄＤＮＡ，简称ｂＤＮＡ）和侵染探针（Ｉｎｖａｄｅｒ）技术［６］。分支探针制成树状或梳状分支状，茎杆区与靶核酸互补，树状或梳齿序列与标记探针互补，分支越多，结合的标记探针也越多，则可检测的信号越强。Ｃｌｉｔｏｎ公司１９９４年推出检测病毒的分支探针试剂盒，且已应用于ＨＩＶ、ＨＣＶ（两型肝炎病毒）、ＨＢＶ（乙型肝炎病毒）等病毒的检测，有望用于禽流感的检测。侵染探针技术是一种等温非“ＰＣＲ”的ＤＮＡ和ＲＮＡ的定性、定量检测技术。侵染探针体系包括侵染探针和信号探针，侵染探针完全与目标序列配对，信号探针３＇端序列完全与目标片段互补，由于侵染探针和信号探针与目标ＤＮＡ杂交有重叠（至少重叠一个碱基）结构，故信号探针５＇端不能与目标片段结合而呈翼状突起，该结构被核酸内切酶（ＦＥＮ１酶）识别并剪切掉信号探针５＇端翼状突起，剪切后的信号探针与目标ＤＮＡ解离，并有新的信号探针重新与靶ＤＮＡ序列结合，随后也被核酸内切酶剪切解离。分析酶切下来的片段可判断靶核酸的有无。为了使检测信号进一步放大，Ｈａｌｌ等（２０００）将上述酶切下来的信号探针５＇端片段，再作为侵染探针与按同样原理设计的另一信号探针共同结合靶ＤＮＡ，再次形成侵入结构，同样被核酸内切酶（ＦＥＮ１酶）识别并剪切掉信号探针５＇端片段，但该信号探针５＇、３＇端分别带有荧光基团和荧光淬灭基团。由于酶切作用破坏了两基团间的荧光共振能量传递（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，简称ＦＲＥＴ）作用［７］，荧光读取器则可检测到荧光信号。这样我们可以选择禽流感核蛋白基因（ＮＰ）（型的诊断）和血凝素

禽流感是Ａ型禽流感病毒引起的一种禽类的感染或疾病综合症。自１８７８年首次发现该病毒以来，现已广泛分布于世界各地的家禽及野禽中。高致病性禽流感（Ｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ，简称ＨＰＡＩ）可导致禽类大批死亡，并严重威胁着人类公共卫生安全［１］；低毒力株能明显降低家禽的生产性能，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强［２］，故世界各国对禽流感的早期、快速、准确诊断极为重视。常规诊断方法有病毒分离、电镜观察、血凝（ＨＡ）及血凝抑制（ＨＩ）试验、神经氨酸酶抑制试验（ＮＩＴ）、病毒中和试验（ＮＴ）、琼脂凝胶扩散试验（ＡＧＰ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫组织化学以及免疫荧光技术（ＩＦ）等［３］。但这些方法或多或少存在一些不足，如：检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、不能检测病死材料以及不适合对活禽市场环境和进出口畜禽产品的大样本检测。于是由传统检测方法、分子生物学技术等演变出各种各样新的检测技术，这都将有助于禽流感的尽早、快速、准确诊断。

１核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术用于病毒检测主要是探针法。

对探针（ＤＮＡ、荧光、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ）进行同位素、生物素、酶或地高辛（ＤＩＧ）标记，再与病毒的基因组进行杂交，通过标记物进行杂交信号的检测。黄庚明等

陈思怀，西南农业大学动物科技学院，讲师，４０２４６０，重庆荣昌。乔宪凤（通讯作者）、魏庆信，湖北农业科学研究院畜牧兽医研究所。

张涌，西北农林科技大学生物工程研究所。收稿日期：２００５－０９－０５

★湖北省科技攻关项目（２００４ＡＡ２０２Ｂ０３）