动物医学进展。 2 0 1 3, 3 4 ( 1 2 ): 5 1— 5 4 Pr o gr e s s i n Ve t e r i na r y Me di c i ne

猴逆转录病毒 R T - P C R和 R e a l— t i me R T - P C R检测方法的建立 熊 炜，蒋静，张强，盘宝进，李健，魏晓锋。,黄忠荣，胡建华。 ( 1 .上海出入境检验检疫局，上海 2 0 0 1 3 5; 2 .广西出入境检验检疫局，广西南宁 5 3 0 0 2 8; 3 .上海实验动物研究中心，上海 2 0 1 2 0 3 )

摘

要：猴逆转录病毒 ( S i mi a n t y p e D r e t r o v i r u s, S R V)是引起猴获得性免疫缺陷综合征 ( S i mi a n a c—

q u i r e d i mmu n o d e f i c i e n c y s y n d r o me, S AI DS )的病原之一，其严重危害猴的健康，并威胁与猴接触人员的健

康，是无特定病原体 ( S P F )猴必须排除的病毒之一。为了应对口岸对进出境野生及实验用灵长类动物 s R V感染情况的监测和流行病学调查的需要，建立了 R T— P C R和 r e a l— t i me RT— P C R检测 S R V的方法，并对方法 的特异性、敏感性和稳定性进行了验证。

关键词：猴；猴逆转录病毒； R T— P C R; r e a l— t i me RT— P C R; T a q Ma n探针 中图分类号：￥ 8 5 2 . 6 5 9 . 3 文献标识码： A 文章编号： 1 0 0 7— 5 0 3 8 ( 2 0 1 3 ) 1 2 - 0 0 5 1— 0 4

猴逆转录病毒 ( S i mi a n t y p e D r e t r o v i r u s, S R V)属于逆转录病毒科，肿瘤病毒亚科的 D型病毒，因此被称为猴 D型逆转录病毒。S R V的基因组为单负链 R NA,内含逆转录酶，病毒颗粒呈球形。S R V主要通过体液传播，与猴免疫缺陷病毒 ( S i mi a n i mmu n o d e f i - c i e n c y v i r u s, S I V)相同，均能导致猴获得性免疫缺陷

品系改良用实验猴最多。目前 S R V检测的方法主要有病毒分离培养，间接免疫荧光 ( I F A)、酶联免疫吸附

试验( E L I S A)、免疫印迹 ( We s t e r n b l o t )和 R T - P C R检测等血清和分子生物学检测方法n]。为了应对口

岸大量进出境野生和试验用非人灵长类动物疫病筛 查和流行病学调查的需要，本研究建立了 R T - P C R和 r e a l - t i me R T - P C R快速检测 S R V的方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证。

综合征 ( S i mi a n a c q u i r e d i mmu n o d e i f c i e n c y s y n d r o me, S A I D s ),由此引发一些列疾病，包括腹泻、贫血、体重减轻、脾肿大、淋巴结病、中性粒细胞减少症、表皮纤维瘤和腹膜后纤维瘤等[ 1。]。目前，发现的 S R V有 7 个血清型，即S R v _ 1~7,其中 S R V - 1~3型的前病毒

l材料与方法 1 . 1材料

D N A已全基因克隆并序列分析。S R V - 1、 S R V - 3和 S R V _ 5主要流行在亚洲和印度恒河猴中， S R V- 2主要流行在东南亚食蟹猴和豚尾猴中r 5。]。S R V在其天然宿主亚洲恒河猴中可以致病，且流行率很高，一旦暴 发可能导致整个猴群大批死亡，如 2 O世纪 7 O年代末

1 . 1 . 1 主要试剂

T r i z o l为 I n v i t r o g e n公司产品；

T a q酶、 A MV逆转录酶、 R N A酶抑制剂、 d NT P、随机引物、 D NA Ma r k e r D L 2 0 0 0为宝生物工程 (大连)有限公司产品。 l _ l _ 2 病毒样品来源及处理 S R V阳性组织和血清

和 8 O年代初，美国数个灵长类动物研究中心，因S R V样本来自广西出入境检验检疫局。阳性组织样品加 3 0 0 0 r/ mi n离心 1 5 mi n, 引起 S A I D S的暴发导致大批实验猴死亡l 8 _ 9 _。S R V 等体积生理盐水研磨匀浆，

作为一种重要的非人灵长类动物传染病病原，不仅严重威胁猴的健康，还可感染接触它的饲养人员和科研 人员 l _ 1,并严重干扰试验结果，因此成为灵长类实验

收集上清液待检。其他病毒核酸，如猴 T淋巴细胞趋向性病毒 l型( S i mi a n T _ c

e l 1 l y mp h o t r o p i c v i r u s t y p e 1, S T L V- 1 )、猴免疫缺陷病毒 ( S i mi a n i mmu n o d e i f c i e n— c y v i r u s, S I V)、猴 B病毒 ( S i mi a n B v i r u s, S B V)由广西出入境检验检疫局提供。 1 . 2方法

动物必查的传染病，也是我国出入境口岸重点监测的 动物传染病病原。近年来，由于国内和国际上生物和

医药研究及观赏的需要，我国口岸每年有数万只野生和人工养殖猕猴、食蟹猴出口及引进，其中尤以广西

1 . 2 . 1 R NA抽提及 c D N A模板制备取 1 0 0 L待

实验猴的养殖和出口规模最大，以东南亚国家进口的检上清液或血清，加 1 mL T r i z o l试剂，用枪头吹打 2 O 收稿日期： 2 0 1 3— 0 7— 1 5 基金项目：上海市科委“科技创新行动计划”项目( 1 1 1 4 0 9 0 1 1 0 0 )

作者简介：熊 炜( 1 9 7 4一),男，江西南昌人，高级兽医师，博士，主要从事病毒的检测和分子生物学研究。