第30卷第4期湘 潭 大 学 自 然 科 学 学 报Vol.30No.4 2008年12月NaturalScienceJournalofXiangtanUniversityDec.2008

改进SDS 底物 PAGE技术鉴定淡水鱼消化酶

刘忠义1, 王 璋2, 许时婴2

(1.湘潭大学生物与食品工程系,湖南湘潭411105;

2.江南大学食品科学研究所,教育部食品科学与安全重点实验室,江苏无锡214000)*

[摘要] 改进SDS 底物 PAGE技术以用于分析检测淡水鱼中的消化蛋白酶.主要改进了胶浓度、反应温度和时间以及

底物蛋白质浓度和处理时间等因素.试验表明:用150g/L的分离胶,胶片在4 30g/L的酪蛋白溶液中浸泡90min,然

后在35 保温120min,结合专一的蛋白酶抑制剂,使用SDS 底物 PAGE技术可以检测出草鱼和青鱼肠道中碱性白蛋

酶的种类、数量,并推算出它们的分子质量.草鱼肠道中有3种胰蛋白酶,1种非丝氨酸蛋白酶,它们的分子质量分别为:

26.4kDa、30.75kDa、40.5kDa和约105kDa.青鱼肠道中有2种胰蛋白酶,2种胰凝乳蛋白酶,1种非丝氨酸蛋白酶,它

们的分子质量分别为:27.5kDa、30.1kDa、40.5kDa、42.5kDa和78.5kDa.

关 键 词:SDS 底物 PAGE;PAGE;草鱼;青鱼;碱性蛋白酶

中图分类号:Q556.1;Q176 文献标识码:A 文章编号:1000 5900(2008)04 0112 05

CharacterizationofFreshwaterFishDigestiveProteinasesby

ModifiedSDS Substrate PAGE

LIUZhong yi1,2, WANGZhang2, XUShi ying2

(1.DepartmentofFoodandBiotechnologyofXiangtanUniversity,Xiangtan411105;

2.FoodScienceInstituteofSouthernYangtzeUniversity,

KeyLaboratoryofFoodScienceandSafetyofMinistryofEducation,Wuxi214000China)

Abstract! SDS substrate PAGEmethodwasmodifiedandusedtocharacterizetheproteinasesfromthe

digestiveorgansoffreshwaterfish.Theconcentrationofseparatinggel,reactiontemperature,reaction

time,substrate(protein)solutionconcentrationandgelsoakingtimeinthesubstratesolutionweremodi

fied.Using15%ofseparatinggelandspecificproteinaseinhibitors,soakinggelinto3%ofcaseinat4

for90minandthenincubatinggelat35 for120min,SDS substrate PAGEcouldbeusedtocharacterize

types,numberandmolecularmassoftheactivecomponentofalkalineproteinasesfromgrasscarp

Ctenopharyngodonidella(Val.)andblackcarpMylopharyngodonpiceusviscera.Therewerethreetypes

oftrypsinsandanun serineproteinasewithmolecularmassesof26.4kDa,30.75kDa,40.5kDaand105

kDa,respectivelyinthegrasscarpdigestivetrack.Thereweretwotypesoftrypsins,twotypesofchymo

trypsinsandanun serineproteinasewithmolecularmassesof27.5kDa,30.1kDa,40.5kDa,42.5kDaand

78.5kDa,respectivelyintheblackcarpdigestivetrack.

Keywords: SDS substrate PAGE;PAGE;Grasscarp;Blackcarp;Alkalineproteinase

蛋白酶在生物体内的作用十分重要,在食品工业等很多行业都有广泛应用[1].在很多情况下尤其是研究新蛋白酶种类或者新研究对象里的蛋白酶时,需要快速准确鉴定蛋白酶的种类并了解蛋白酶的分子质量.SDS 底物 PAGE[2]把SDS PAGE、酶谱以及专一性抑制等几种技术结合起来,能简单方便地在一张电泳胶片上分离并鉴定蛋白酶,即使是粗提取物中的蛋白酶也能得到很好的分析鉴定.其基本原理是先将蛋白酶样品在含十二烷基磺酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶片上电泳分离,然后用一定的方法使胶片里已经分离的酶恢复活性,再将胶片浸泡在蛋白质底物溶液里,让胶片吸收蛋白质,在一定条件下让胶片里的酶水解吸收到胶片里的蛋白质底物,水解结束后,再用考马斯亮蓝将胶片染色,然后脱色.由于整张胶片吸收了蛋白质,因此被染为蓝色或者蓝紫色.但是有蛋白酶活性的部分由于蛋白质被水解,在胶片固定和脱色过程中,低分子肽从胶片中溶入溶液里,因此不被染色而出现明亮的条带;或者由于水解物或者蛋白酶自溶物与染料结合后的颜色发生变化以及其他原因而在脱色后的胶片上显示颜色更

收稿日期:2007 12 19

基金项目:湖南省教育厅资助项目(02C580);江苏省科技厅科技攻关项目(BE2003316) :( 男,,,博士. ail:xtu.edu.*