高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）

HPLC应用

一、样品测定

1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。

2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。

4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）

5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。

6．仪器的使用：

①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。

②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。

③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。

④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。

⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。

⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。

二、方法研究

1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。

2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。

附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则

一、对起草单位的要求：

1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。

2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。

3．建立方法时，应考虑下列事项：

①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。

②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。