木质纤维素制取燃料乙醇菌种的研究

可再生能源

一种同时利用五碳糖和六碳糖产乙醇的菌种，则理论上可以提高２５％的乙醇产量。１可用于生物质乙醇生产的微生物

在利用木质纤维素生产乙醇的研究中，理想的菌种要具备２个特点：一是能够广泛利用多种底物发酵生产乙醇，尤其是半纤维素水解产生的五碳糖。这是因为半纤维素是木质纤维素的重要组分之一，由其水解所产生的五碳糖在水解液中占很大比例，将这些五碳糖发酵成乙醇，是降低燃料乙醇生产成本的关键。二是菌种对发酵抑制剂具有耐受／代谢能力，木质纤维素在稀酸水解过程中，产生大量的发酵抑制因子，如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等，菌种对这些毒性化合物的耐受能力是影响木质纤维素稀酸水解乙醇发酵的关键因素。传统上用于乙醇发酵的微生物都不能够代谢五碳糖，而能够代谢五碳糖的菌种在抑制因子耐受能力方面又有所欠缺。因此，在过去的２０年研究中，寻找或构建理想的菌种一直都是科学家研究的主要课题。１．１酵母菌

有些酵母菌能发酵木糖产生相对较大量的乙醇。研究发现，树干毕赤酵母发酵木糖的能力优于其它酵母，它能在厌氧条件下较快地发酵木糖产生乙醇，但乙醇产率较低，其木糖代谢酶和对木糖的转运受葡萄糖的抑制，而且要求控制精确的供氧浓度，上述缺点都限制了它在乙醇发酵工业上的应用。酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌株，它不仅有很高的乙醇耐受能力，而且对木质纤维素水解液中的抑制因子有一定的耐受能力。酿酒酵母不能发酵木糖，但它具有编码木酮糖激酶的基因ＸＫＳ１，所以能发酵木糖的异构体———木酮糖。

研究发现，在木糖培养基上，质量分数为０．５％的乙酸就完全抑制了休哈塔假丝酵母和毕赤酵母的生长，只有嗜鞣管囊酵母表现出较低的增长和产生少量的乙醇。在葡萄糖培养基上，酿酒酵母对乙酸的敏感性低于上述任何木糖发酵酵母。通过比较研究发现，毕赤酵母对糠醛、羟甲基糠醛和乙酸等抑制因子比较敏感，而糠醛和羟甲基糠醛对嗜鞣管囊酵母的影响较小。因此，人们开始尝试通过各种育种技术，以酿酒酵母为宿主菌构建能发酵木糖产生乙醇并有耐受发酵抑制剂能力的酵母工程菌。 ５４

１．２细菌

２００７，２５（４）

大部分细菌都能在木糖异构酶的作用下将木

糖一步转化成木酮糖，但它们在产乙醇的同时还会产生副产物，乙醇的转化率比较低，从而影响乙醇的得率。厌氧嗜热梭菌能直接利用纤维素和半纤维素生产乙醇、乳酸和乙酸［３］。

运动发酵单胞菌最早发现于非洲等热带地区的果酒中。１９世纪５０年代早期，人们发现运动发酵单胞菌在厌氧条件下主要通过ＥＤ途径代谢葡萄糖，它可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖等六碳糖产乙醇，但不能利用五碳糖生产乙醇。磷酸化的葡萄糖经ＥＤ途径产生丙酮酸，丙酮酸由脱羧酶脱羧生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下形成乙醇。迄今为止，运动发酵单胞菌是唯一一种通过ＥＤ途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，其独特的代谢途径使其成为构建产乙醇工程菌的优选宿主之一。大肠杆菌等野生肠杆菌具有较广的底物利用范围，可以代谢六碳糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖）、五碳糖（木糖和阿拉伯糖）以及糖醛酸（半乳糖醛酸、葡糖醛酸）生成代谢中间产物———丙酮酸。大肠杆菌的糖代谢途径和生理机制比较复杂，六碳糖主要经糖酵解途径代谢，五碳糖主要是通过磷酸戊糖途径并与ＥＤ途径相偶联进行代谢。一般情况下，发酵条件为ｐＨ＝７．０，发酵温度为３０℃或３５℃。大肠杆菌糖代谢的复杂性，决定了它的代谢产物的复杂性。其代谢产物包括一些醛类、醇类和有机酸，乙醇并不是其主要的代谢产物，只是其中很小的一部分，因此传统上一般不用它来生产乙醇。但是大肠杆菌含有代谢五碳糖的磷酸戊糖途径中的整套基因和酶，因此在木糖发酵和混合糖发酵产乙醇的研究中也有一定的研究价值。２乙醇发酵重组菌的构建２．１基因工程酵母菌

将树干毕赤酵母的木糖还原酶基因ＸＹＬ１和木糖醇脱氢酶基因ＸＹＬ２克隆到酿酒酵母中，转化子能在以木糖为唯一碳源的培养基上缓慢生长，但所利用的木糖全部被氧化，乙醇产率相当低。将木酮糖激酶基因ＸＫＳ１克隆到已含有ＸＹＬ１和ＸＹＬ２基因的酿酒酵母转化子中，可使木糖醇的产率降低，乙醇产率明显提高。通过改变酵母菌的木糖代谢途径及克隆控制代谢途径的相关基因，改变碳源的代谢流向，可得到酿酒酵母工程