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度成正比。

内 C 饱和；量最小值时，荧光指示剂的淬火剂 a测用 M n淬灭荧光来求得最小值。? 而对于双波长的荧光指示剂 .比值信号来求胞用内游离 Ca浓度，必校正。用下式计算细胞内游离 不 Ca浓度

第 3代钙荧光试剂 F u一，典型的单波长指示 lo 3是剂 .的最大吸收波峰位于 5 6n,大发射波长为它 0 m最 5 6 n,以在远离 3 0 3 0 n波长范围内测得荧 2 m可 4~ 8 m

光。 lo 3合 C 后的荧光强度比游离态的高出 3~ F u一结 a 5 4 O倍，而避免了透镜吸收和细胞自身的荧光干扰。从 Fu一 lo 3是一种长波指示剂，作为激光共聚焦成像研可究以及与其他类型荧光指示剂结合作双标记研究。由 于 Fu一 l o 3的激发波长位于可见光 .源易找到，格便光价宜， C反应灵敏，对 a目前受到广泛的应用。 2 2测定方法 .使用荧光剂测定细胞内 C 的过程一般包括荧光 a

E a]=KdF/ ( C ( dF )R—R… ) (/ R…一 R) 式中 K为荧光剂与 Ca形成配合物的解离常数。 ” F和 F分别表示荧光剂没有结合 Ca 。被 C 饱和 和 a 时在 3 O 3 0n (于 F r一 )的荧光强度。为实 4~ 8 m对 ua 2处 R验观察到的荧光比值。 R为胞内荧光剂最小量结合… C 时的荧光比值，…为胞内荧光剂被 C 饱和时 a R a的荧光比值。 R和 R…可通过实验测定。…

剂负载、光强度测定和离子浓度计算 3步骤。荧个 2 2 1荧光剂负载 ..目前常用以下方法将荧光指示剂导人细胞。

C 在细胞功能调节上有重要作用，了对其作 a为 用机制有更全面的了解，究胞内 C 浓度的变化是研 a非常重要的。目前由于研究水平的限制，种方法都有各待完善，以预计，着测定技术和仪器装置的不断进可随步，及新荧光剂的合成，定会有更有效的方法出以一 现。 ( H) B

孵育法：光指示剂被酯化后，容易跨过质膜进荧很 入

细胞内。在胞内，形式指示剂被非特异性酯酶水酯解，新与 C 结合。此法不太适用于植物细胞，于重 a由

其细胞壁中存在酯酶，光指示剂在进入细胞前就被荧 分解了。

电击法：击法是用高强度的电脉冲，起细胞自电引 修复性穿孑，游离态的 C 荧光指示剂导入细胞原 L将 a 生质体。此方法最适于细胞悬液，会对细胞造成暂时但性的伤害。

酵母菌发酵产生酒精和二氧化碳的简易实验 酵母菌属兼性厌氧真核微生物，缺氧时进行酒在 精发酵，累酒精和二氧化碳。那么，何通过实验来积如

证明酵母菌在缺氧的条件下，酵的产物是酒精和二发 氧化碳？现介绍一种简易的实验方法： 1酵母菌的培养繁殖取一定量的发面 (乒乓球大约小的一团 )入 2 0ml烧杯内，倒入浓度为 5的放 0 的再 葡萄糖溶液至烧杯的 1 0 ml刻度处，玻璃棒搅拌 0 的用均匀。盖上培养皿盖后，在温暖的地方培养 3 4h放~ ,以增加菌体数量。 2发酵产物制备取 1支较大的试管 ( 0 mm× 2 0 2 0

显微注射法：微注射法包括离子微电泳注射和显压力注射两种。离子微电泳注射适合于带电荷低分子量指示剂的导入；力注射适合于中性或在电场下不压 移动的荧光指示剂。 酸导入法：法利用酸性条件下 .示剂处于不带此指电荷的非解离状态，可能通过细胞膜进入细胞内， 有由

于细胞质中 p较高，示剂发生解离，细胞质中的 H指与 C 结合。此法对细胞无害，适于单个细胞，适于 a既也悬浮液测定，能用于植物细胞。还 2 2 2荧光强度的测定 ..

mm )将上述烧杯内的培养液用玻璃棒搅拌后倒入试，管中，至约距试管口的 4倒 0mm处，上带 u型玻璃塞

管的橡胶塞，试管放入 3~ 3 水中保温 1 n将 5 7C的 0mi 左右，可进行检验酵母菌发酵的产物。即 3发酵产物的检测检验时，一支较小的试管 ( 取 1 5 mm× l mm )注入约 l 澄清的石灰水， U型玻 5, 0ml将璃

管的另一端开口伸入到该支试管的液面下。注意观

测定仪器：目前常用的有荧光分光光度计、微荧显光光度计、光共聚焦扫描显微镜以及荧光比率图象激 技术等。

影响因素：示剂区域化、光衰减或光漂白、指荧酯不完全水解、灭剂的干扰以及细胞荧光自身干扰等，淬 都会影响荧光指示剂测量结果。 2 3离子浓度的计算 .

察玻璃管内排出气泡情况和澄清石灰水的变化：初起随着排出气泡的逐渐增大，气泡的边缘处出现白雾在 状混浊；来随着气泡的不断排出，清的石灰水即变后澄得混浊。当完成检验好排出的气体后，开试管塞，打在

对于单波长激发或发射的荧光指示剂，按下式可 计算

管口处便会闻到清香的酒味。从试管内取 l滴发酵液 做成装片，在显微镜下观察，见大量的酵母菌。由放可 此证明酵母菌发酵产生酒精和二氧化碳。 洪正树 (门县第二中学安徽祁门 2 50 )祁 4 6 0 ( BF )

[] Ca:KdF— F ) (…一F) (…/F 式中 K为荧光剂与 c形成配合物的解离常数。 a F和 F为最小荧光强度和最大荧光强度。校正方法……是：量最大值时，一种 C。体 (: 3 8 )胞测用 a载如 A2 l 7使生物学

通

报

20 0 2年第 3 7卷第 l O期